免疫学测量（immunoassays）对一些不需要放射性试剂的方法具有很高的灵敏度，并且快速、不需特殊设备。免疫学测量方法还需要相当长一段时间的发展，因为它需要在精密度（测量的可重复性）、准确度（所测量的抗原表位的数量是否能良好的反应所定量的分子）和灵敏度之间做出选择。其他技术对定量一些标志物也是有用的。高压液相色谱分析方法已证明是有效的，在定量一些标志物时，它具有很高的灵敏度和特异度，例如：对于氨基葡糖多聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的二糖重复单位和胶原的吡啶交联物（pyridinium cross-links of collagen）等的测定已显示出了它的作用。另外，关节基因标记的检测和其他有标志的分子改变的检测手段已成为分子生物学研究的热门。

不管采取何种方式研究，都要追踪到标志物上，这些代谢标志物大多存在于体液内，如关节液、血液和尿液。在定量标志物时，选择哪种体液是十分关键的。下面予以分别叙述。

正常膝关节滑液量约为4ml，白细胞数量小于200/ml，小淋巴细胞和单核细胞占优，还有少量的多核细胞，关节液并非是血浆的超滤液，而是一种分泌量较小的含有少量白细胞，高度不凝的，无色透明或淡黄色液体。而异常滑液性状可以改变，如滑液量增加，黏稠度降低，凝固，浑浊，颜色改变等，当测定发生于滑膜关节的异常代谢过程时，这时滑液的分析往往比活检能提供更多的诊断证据。关节液内的标志物包括关节的所有或大多数组织的分子和片段。与血液、尿液不同的是，对关节液内标志物的分析提供的是单个关节内所发生变化的信息。关节液分析结果比血清或尿液的分析结果要易于解释。例如：可聚蛋白多糖中的大多数氨基葡糖多聚糖结合片段在它们形成以后就从关节软骨内扩散出来，对关节液内这种片断的测量被认为是这个关节内可聚蛋白多糖降解速度的测量方法。软骨基质其他成分的降解产物要结合或者被束缚在组织内一段相当长的时间，它们扩散出软骨需要反复性的蛋白水解作用或关节负重所引起的抽吸作用或所存在的基质的严重破坏。这对于不形成易溶解的胶原纤维结构的成分来说更是如此。

关节软骨和关节其他组织的降解片断从关节液中清除的相对较慢。例如：蛋白多糖单体的清除半衰期大约为12小时。这有助于解释为什么标志物可以在关节液内达到较高的浓度。一些标志物分子通过进入淋巴系统而从关节液内清除，但是有相当的比例可以直接进入关节的血液循环系统，它们可能是通过进入关节滑膜内的毛细血管网而得以清除的。进入淋巴系统的分子的最终结果人们还知道得很少，然而一些研究表明，一些标志物分子例如透明质酸可以通过胸导管返回循环。但其他标志物并不一定是通过这种途径。例如：硫酸角质素在进入淋巴系统后，在通过胸导管进入循环系统之前通过与硫酸角质素抗体结合而失去被识别的能力。

用关节液来测量标志物在某一关节组织的代谢过程有以下几个优点：第一，某些标志物在关节液内的浓度通常较血液或尿液中的浓度高。这并不足为奇，因为关节液离它所起源的组织最近。同时也从另一个侧面反映了这样一个事实，即大多数标志物在关节液内的半衰期至少比在血液中的半衰期要高一个数量级；第二，因为标志物在进入血液循环系统之前，将在关节液或淋巴系统中进一步降解，关节液提供了用来识别从关节软骨所释放出的所有片段的更多的机会。

然而，与血液或尿液相比，对关节液的分析可能存在一些弊端：第一，它不易获取。第二，标志物的浓度依关节的液体通量而定，而在疾病过程中这往往是不定的，因为关节液的体积存在很大的变化，对某一标志物浓度的测量不能准确计算出它的总的数量。Levick建议在考虑到关节内透明质酸的浓度（可获得相对容积）和关节液更新率以后，关节滑液内标志物的浓度可被重新解释。围绕这一问题，关节灌洗（lavage）看来是一种有效的方法，因为通过这种方法可以得到关节液内标志物的总量。但是关节灌洗可对某些关节组织的代谢过程产生极大的影响，这种反复冲洗的方法在对同一关节进行的长期研究的过程中应予以尽量避免。

一项早期研究结果表明，滑膜炎的存在并不能显著地影响代谢性标志物从关节内清除的速度。然而Myer和他的同事们认为，狗膝OA和滑膜炎的存在导致蛋白清除率显著增加。尽管各家报道结果存在很大矛盾，但是因OA患者关节内大多数标志物水平比正常关节内相应标志物的水平明显增高，所以清除率的极小变化并不会显著地影响对数据的解释，故仍可用关节液作为测量代谢标志物的媒介。

血清和血浆的主要优点是它们容易获得，另外，其容量相对稳定且与关节容量无关。它的最大缺点是很多标志物的浓度处于目前定量测量方法的可探测浓度之下。

在表6-1和表6-2中所列的几种代谢标志物的浓度提供了关节组织代谢过程和一般状况的重要信息。例如，研究表明，如果OA患者的血清中透明质酸（hyaluronan）或软骨寡聚基质蛋白质（oligomeric matrix protein，COMP）的浓度升高，其关节更易于表现出渐进性损害。需要引起重视的是：以前用来评价关节软骨代谢过程的大多数血清标志物大多起源于关节外组织，实际上它们所反映的是包括体内全部或大多数软骨组织的系统代谢异常，因为滑膜关节内软骨占体内软骨组织总量的不足25%，在某一时间点上所取得的血液中的软骨代谢标志物在大多数情况下不可能说明OA患者或者创伤患者关节内正在发生什么样的变化。

总体说来，血液循环中的代谢标志物比关节内标志物的分子量小且半衰期短。例如：对可聚蛋白多糖起源的标志物来说，较大片断相对来说清除地快（半衰期小于5分钟），主要是结合于硫酸软骨素受体、硫酸角质素末端的半乳糖残基受体和未硫酸化的寡聚糖受体。存在于血液中的小分子片段清除地较慢（半衰期长达50分钟），它们主要通过肾小球基底膜的滤过作用而清除，但只限于小分子及带负电荷少的物质。透明质酸从血液中清除也较快（半衰期为2～3分钟），主要经肝脏而代谢。目前关于其他分子标志物的代谢过程知道的尚不多。

对血清或血浆内标志物的测量也可用来监测机体对药物、生长因子、细胞因子的反应以及对其他试剂或存在于循环系统的因子的反应，因为通过血液循环它们可以达到几乎全身所有软骨组织内的软骨细胞。

因为尿液是血液的滤过产物，尿液内软骨起源的标志物的水平也可以反映机体内所有软骨组织代谢的平均水平。然而，因为大多数高分子肽和带负电荷多的分子，例如蛋白多糖起源的片段，不能通过肾小球内带负电荷的基底膜，所以尿液内不可能包含和血液内一样多的分子标志物。尿液易于获得，但大多数软骨起源的标志物在尿液内的浓度太低而不能被检测出来。胶原的吡啶并林交联物则是这一规则的一个明显的例外。它是存在于成熟胶原组织中的3-羟基吡啶复合物（Pyr），是经组织中赖氨酰氧化酶的特殊催化作用而形成，是胶原纤维分子间及分子内的交联体，对于稳定胶原网络结构有重要的作用，并随胶原的分解而释放入血，以原形形式经尿液排出，因此，测定尿中Pyr浓度的变化就可以反映胶原的降解情况，Pyr在体内比较稳定，其生物合成随着成人胶原含量的增加而增加。正常成人尿中Pyr没有显著的性别和年龄差异，并与饮食、运动及肾功能情况无关。因为它在尿液中被浓缩，其在尿液内的浓度比其在血液内的浓度明显增高。有研究显示OA患者出现尿中Pyr含量的升高，并与其严重程度有关。因此，认为Pyr可能成为OA诊断和监测的生化指标。

体液代谢标志物可以为关节内组织的特异代谢过程提供诊断和治疗的许多有价值的信息，因此对于这些代谢标志物的深入研究仍然具有很重要的临床及科研意义，这些价值主要归结为以下几点。

在确定代谢过程对关节软骨功能的影响时，代谢标志物也是非常有用的。例如：已经观察到一部分多关节OA患者的血清AgKS水平升高，Thonar和他的同事们认为可聚蛋白多糖降解的这种标志物实际上可能在临床症状出现之前就已经开始了。按照这种假说，关节软骨基质代谢率高的正常成人与关节软骨基质代谢率低的人相比，关节软骨的降解可能更易于发生于前者。由于目前还不能在临床前期发现原发性全身性骨关节炎，验证这样一个假说需要对人群的长期前瞻性研究。

发现处于临床症状不明显时期的原发性OA是一项长远的目标，目前看来没有一项代谢标志物可以确定一项对于OA独特的代谢异常。但OA关节液中COMP片段与RA中的不同这一事实说明：有良好疾病特异性的代谢标志物是可能获得的。在更早期阶段确定OA时，如果这样的片段进入了血液循环，采用能够测量其N末端或C末端的测定方法就会变得非常有用。

许多OA生物标志的研究主要集中在相对风险或优势率的测量上，很少人采取更恰当的诊断试验评价标准来评价一项疾病过程的指标。最近有研究报道的优势率联合一个和疾病情况有关的特定的生物标记令人印象深刻而诊断性试验却没给人留下深刻印象。这样的生物标记不会作为有价值的OA诊断测试。

膝关节创伤后OA中标志物变化的研究对于诊断放射学OA的早期诊断是一种很有吸引力的方法，因为疾病过程的开始可在创伤的同时确定。对这一高危人群的研究也使得以下成为可能：①在疾病进展过程中，通常可相对更快地对患者进行前瞻性观察，包括临床体征。②为了早期和精确对创伤进行诊断，可在任何时刻进行关节镜检查。

在人类，韧带或半月板外伤后，膝关节在解除制动后几小时内就会导致关节液内可聚蛋白多糖裂解片段浓度的增加。其浓度大约在1周后达到最大值，然后显著得下降。这些片段的浓度，可以通过测量关节液内可聚蛋白多糖核心蛋白起源的抗原表位或AgKS而获得，他们通常保持升高达几年。对交叉韧带和半月板损伤的患者来说，其变化有相同的数量级和持续时间，而对膝关节疼痛但没有内部支持结构损伤的患者来说并不常见。对关节液内可聚蛋白多糖不同片断的测量可提供关于受损关节软骨所发生变化以外的信息。例如：Shimnei和他的同事们已证明，在创伤和原发性OA的关节内，6-硫酸软骨素/4-硫酸软骨素的比值比RA关节内的比值要明显高。这一比值提供了独特的诊断信息，因为在RA和OA患者之间它们没有重叠。

有几项研究已证明，在有膝关节损伤的患者或创伤后OA患者的关节液内，一些分解代谢酶类，尤其是金属蛋白酶类（MMP-3，MMP-1）水平也升高。Lohmander和他的同事们把关节液与正常做对照后发现，MMP-3的浓度在膝关节受损伤后几小时内浓度开始升高，在几周后浓度达到最大，然后下降。然而与正常对照比较，它的浓度的确可以保持升高达几年。受损膝关节滑液内MMP-3的水平是胶原酶的10～100倍，这两种酶的浓度比RA患者关节液内的相应浓度都低。虽然创伤或原发性OA患者的关节液内TIMP的数量也增加，但是，在关节损伤后和OA的关节液内，proMMP-3/游离TIMP的克分子浓度比显著增加。克分子浓度的这种变化至少部分地反映了关节软骨发生了改变。有两项独立的研究表明人类OA关节软骨的提取物中MMP活性比TIMP的活性高。但是需要进一步研究以确定关节液内MMP-3（主要是酶原）的高水平是否反映了软骨内有活性酶类的浓度。

虽然对人类遭受创伤膝关节的研究还没有直接的证据表明可聚蛋白多糖分解代谢的增强与可聚蛋白多糖合成的增加相平衡，但这是必然的，因为关节面通常在几年后才发现有退变的征象。创伤性OA患者的关节液内Ⅱ型胶原C-前肽（chondrocalcin）——Ⅱ型胶原合成的一种标志物，它的浓度升高，这一发现与通过增量调节生物合成途径而使软骨对损伤发生反应的观点相一致。创伤和原发性OA患者的这一标志物浓度比RA或感染性关节炎患者的高，它支持OA患者的降解过程至少在早期阶段被生物合成过程所平衡这一得到广泛认可的观点。

动物实验已提供了滑膜关节受到创伤后关节软骨发生变化的有用的信息。横断成年狗膝关节前交叉韧带后2～3个月，手术关节的关节软骨负重区发生轻度退变。在经过几年后病变进展，关节面全层发生溃疡。对狗手术的膝关节关节软骨的体内和体外研究证明：在术后2周内，可聚蛋白多糖的生物合成和分解代谢过程均增加了。这些显著的变化至少在前6周内并没有引起组织内可聚蛋白多糖浓度的任何变化，这显然表明可聚蛋白多糖分解代谢的增加被它的合成所平衡。对损伤发生反应的软骨细胞看来可以影响软骨基质的许多成分。横断前叉韧带3个月后的关节液表明，AgKS、硫酸氨基葡萄糖多聚糖和连接蛋白的水平也升高。对关节软骨细胞进行的培养表明，这些基质成分的丢失速度是没有手术的对侧膝关节的几倍。目前可以获得关于其他软骨基质蛋白功能的更多资料，其中一种或几种可能成为胶原结构不稳定的理想标志物，或者是基质结构其他特定伤害改变的标志物。这样，Ⅱ型胶原、Ⅸ型和Ⅹ型胶原（它们被OA患者的一些关节软骨所合成）可能会受到重视。对人类膝关节创伤的前瞻性研究可以帮助判断在早些时候，某一个体关节组织的反应是否有助于判断OA关节发生的变化。

研究结果表明膝关节损伤可使血清AgKS水平的升高。狗前交叉韧带损伤模型的骨代谢标志物（D-吡啉啶）、滑膜代谢标志物（透明质酸）、软骨代谢标志物（AgKS）的血清水平在术后2～3周内显著升高（图6-1），并保持稳定在高水平至少6个月。不同时间的变化有明显的不同，这些变化的数量级明显比前交叉韧带断裂后关节液变化的数量级低。然而，还不能排除与人类关节液变化的非一致性，同时狗血清的这种变化至少反映了不同物种的关节对创伤的反应不同。狗血清标志物水平的变化也有可能反应骨或其他关节组织受到创伤后的代谢变化。在手术后6周把狗杀死，对侧没有手术的膝关节滑膜细胞透明质酸的合成增加；以前的观察还发现，骨反复创伤使体内其他部位的骨产生代谢改变。基于这些发现，这也就不奇怪了。正常情况下存在于气管软骨的148kDa软骨基质蛋白是不存在于关节软骨内的，对它进行测量可以帮助确定这些合成变化是否也影响其他软骨组织的代谢。RA患者这一分子的血清水平是升高的，这导致学者们猜测RA患者的大多数软骨组织内这一物质的代谢过程发生了改变。

OA通常被认为是一种继发有软骨下硬化的软骨性疾病。这提示至少在某些亚型的OA中，软骨下骨硬化起到了病因学上的作用。人们观察到，一些OA患者关节液和血清内骨唾液蛋白和尿内骨胶原的吡啶交联部分水平升高。这一现象使得Gever和DeQueker以前关于全身性OA患者的骨钙素血清水平升高的这一论证更加具有正确性，他们认为骨基质的几种成分在此疾病过程中发生了代谢改变。对具有发展为OA的高风险亚群的骨和软骨特异性标志物血清水平而进行前瞻性研究，这些研究有助于确定骨代谢过程的这一变化是在关节软骨代谢改变之前还是之后。这样的研究在创伤后和原发性OA患者的关节软骨和其软骨下骨的错综复杂的相互作用方面已证明是非常有用的。

D-吡啉啶，骨特异性吡啉啶交叉部分，在狗的前交叉韧带切断后其血清水平迅速上升。人们希望测量尿中这种物质的水平以证明在可导致OA形成和发展的早期骨改变过程中它具有重要的作用。因为机体内所有的骨促成了D-吡啉啶在尿中达到一定的水平，所以一个关节内发生的损伤不可能产生尿中D-吡啉啶水平的显著升高。另一方面，尿中D-吡啉啶的测量在确定由创伤引起的骨系统性代谢改变时是非常有用的。

生物标记在评价OA的治疗效果中有很高的价值，特别是传统或是形态学上的治疗效果测量并没有取得很多的成果。生物标记物在其他疾病包括血压和在HIV/AIDS中病毒载量的测量上发展的成功。然而在其他如骨质疏松的骨质密度方面一直提倡，但并不一定反映了骨折治疗的主要临床效果。这是一个特例，例如在氟化物的实验中建议使用氟化物来改善骨密度，但氟治疗试验在一些情况下会使骨折恶化。

标志物最明显的作用之一是能阐明特定药物在关节组织代谢过程中的作用。以前很少有人尝试去这样做，然而文献上充斥着很多关于特定药物刺激或下调移植细胞、悬液内或单层软骨细胞代谢过程的文章。目前还没有证据来证明存在一种合适的办法以确定药物在体内是否有作用。例如：文献上记载，非甾体类抗炎药物在体外对关节软骨有一定的作用，但当OA患者口服后，患者的AgKS血清水平不能产生一个可测量到的变化。相反，哮喘的成人口服氢化可的松后可导致血清AgKS水平显著下降，非常重要的是，这些个体的AgKS血清水平直到停止用药1个月后才恢复到术前的水平。OA患者单次关节内注射氢化可的松导致不但该关节的关节液AgKS水平显著下降，而且血清AgKS水平也显著下降。这明确表明药物即使是局部注射也能对体内其他软骨组织产生作用。

一项研究表明，在横断前交叉韧带后15天开始，每日给狗皮下注射降钙素，可有效地减轻手术的膝关节继发形成OA的严重程度。用降钙素治疗以使D-吡啉啶交叉部分恢复到手术前水平方面有效，所有狗的血清AgKS和透明质酸恢复到它们的基础水平（见图6-1），这一水平一直持续到治疗结束的第105天。更有趣的是，另一试验组在第49天停止治疗，导致所有的3种血清标志物恢复到在给降钙素以前的高水平。这些发现使人们更加相信，OA病变涉及整个关节，并且表明软骨下骨的代谢改变会导致关节其他组织发生变化。这一研究在OA中具有非常重要的意义，它表明对一些血清标志物的测量在评价药物抑制受损关节的有害代谢过程方面是非常有用的，因此可以延迟病变继续发展或随之而来的关节软骨退变。

最终，作为一个治疗效果的有效评价，对生物标记干预的效果必须可靠地预测对临床治疗效果。值得注意的是Fleming和DeMets，他们关于生物标志预测其临床结果的效果经常失败。原因可能是这样的，这种疾病进程有几种不同因素影响其临床效果，而这个生物标记只是其中之一。最普遍的误解是，生物标记是和临床结果一一对应的（例如在OA的病例中，会认为一个稳定的COMP水平对应着一定时间损失一定量的软骨）。生物标记不仅要与临床治疗效果对应，还要必须得到对临床治疗的净效果。后者则往往很难由一个生物标记来满足。这后一种要求的测试包括实施一项临床试验或多个试验来测量的临床疗效和生物标记，然后测试是否临床治疗效果可以完全由或部分由生物标记来解释。

用血清标志物来预测疾病进展速度是代谢标志物必将常规用于临床的最主要原因。这一观点来源于长期的研究，这些研究表明血清透明质酸、COMP和C反应蛋白增高的OA患者与这些标志物血清水平低的患者相比，随时间的推移他们的关节破坏地更快或者更严重。COMP水平可以反映软骨退化。如果COMP代表了OA的危险因子（例如，如果COMP导致软骨丢失），那么你可以降低COMP的水平以防止软骨丢失。举一个例子，我们可以开发出一种药物加快COMP的代谢来降低其在血液中的水平。但是，这很明显不是一个减缓OA进程的方法，因此COMP不应该被概念化或测试作为一个风险因素。但是COMP是一个衡量标准软骨基质变性的指标，应评估其精确性来评估软骨变性。使用一个金标准（例如，一段时间软骨损失量）来研究是否高水平COMP预测着可能会经历软骨丢失（高COMP水平的积极性预测价值）和是否COMP水平低的人经历软骨丢失阴性的概率低（低COMP水平的高消极性预测价值）。C反应蛋白，一种主要由肝脏合成的分子，它的血清水平具有预测性价值，它主要反映了对抑制软骨基质修复的致炎细胞因子或其他因子的系统性反应。

一项对OA患者进行的研究表明，尽管透明质酸和膝关节内收程度与膝关节间隙宽度有关，但这两项反映疾病严重程度的标志彼此之间并没有相关性。这一有趣的发现提示学者们进行纵向的研究以证实这样一个假说：把步态分析和对血清标志物的测量结合起来以监测OA的变化。