第二节　常用染色方法

流式细胞仪可以对散射光和荧光信号进行采集和分析，其中的荧光信号对于某一次的具体检测而言是特异性的，可以是细胞或颗粒在激发光照射下产生的某种类型的自身荧光，也可以是标本处理过程中，按照检验人员意愿为细胞或颗粒表面或内部的某种特定物质（通常是蛋白质或核酸物质）标记上的荧光物质所发出的特异的荧光信号。使标本中的细胞或颗粒性物质带上某种荧光物质而具有遭受激光照射能够发出相应特异性荧光的处理过程及其全部工艺信息，即荧光染色技术。所使用的荧光物质也称荧光染料、荧光色素或荧光素。

根据流式检验待检内容的性质，荧光染色技术又包括细胞免疫荧光染色技术、核酸荧光染色技术和新发展起来的荧光微球捕获染色技术。细胞免疫荧光染色技术被染色的检测对象是细胞，核酸荧光染色技术被染色的检测对象是核酸（包括DNA和RNA），荧光微球捕获染色技术被染色的检测对象则是以溶质形式存在于液体标本中的蛋白质或多肽等。

一、细胞免疫荧光染色

（一）细胞免疫荧光染色技术的基本原理

细胞免疫荧光染色技术是对细胞表面或内部某种蛋白质或多肽等进行荧光色素标记，借用流式细胞仪达到对细胞中该荧光色素标记靶蛋白质的有无及含量进行测定。

细胞免疫荧光染色技术使用事先被荧光色素标记好的靶蛋白的单克隆抗体（简称荧光标记抗体），与标本中的细胞混合，依靠抗原抗体结合反应的原理，使荧光标记抗体与细胞上的靶蛋白结合，使细胞被荧光染色。因此，细胞免疫荧光染色技术的本质是抗原抗体反应。

（二）细胞免疫荧光染色技术常用荧光染料及特性

1.异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）

FITC是流式细胞术中最常使用的荧光染料之一，分子量为389Da，最大吸收峰为495nm，用488nm的激发光照射后可以发出以520nm为最大峰值的绿色荧光。FITC具有很高的光子产量和能量转换效率，是一种优质的免疫荧光染料。将FITC以共价键方式标记到各种单克隆抗体上，在流式细胞术中得到广泛的应用。

2.藻红蛋白R（R-phycoerythrin，PE）

PE是存在于红藻中的一种可进行光合作用的自然荧光色素蛋白，每个分子含有34个藻红素色团，分子量为240kD，最大吸收峰为564nm，用488nm的激光照射后可以发出以578nm为最大峰值的黄色荧光，是一种理想的免疫荧光染料。

3.德州红（Texas Red）

德州红是硫罗丹明101的硫酰氯衍生物，分子量为625Da，最大吸收峰为596nm，用595～605nm范围的激光照射后可以发出以620nm为最大峰值的橙色荧光，与FITC的光谱无重叠。

4.藻红蛋白德州红偶联物（PE-Texas Red）

又被称为ECD，是藻红蛋白和德州红的偶联物。PE接收488nm的激光照射可以将能量转换给德州红，后者发出以620nm为最大峰值的橙色荧光。但是，ECD与PE之间光谱重叠较重，荧光补偿大，一般不使用ECD和PE进行双色荧光分析。

5.多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）

PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的一种蛋白复合物，分子量为35kD，最大吸收峰为490nm，用488nm的激光照射后可以发出以677nm为最大峰值的红色荧光。PerCP的优点是与FITC、PE进行多色分析时，其荧光光谱与FITC、PE的重叠很少，因此补偿小，但是其光子产量不高，所以只能用于高表达蛋白质成分的表达测定。

6.藻红蛋白-花青素复合物（phycoerythrin and cyanidin，PE-Cy5，简称PC5）

PC5是藻红蛋白（PE）和花青素（Cy5）的复合物，用488nm的激光照射后可以发出以667nm为最大峰值的红色荧光，且光子产量高，与PE之间的光谱重叠非常小。

7.叶绿素蛋白偶联物（PerCP-Cy5.5，简称PC5.5）

PC5.5是PerCP和花青素Cy5.5的偶联物结合物，用488nm的激光照射后可以发出以695nm为最大峰值的红色荧光。

8.别藻蓝蛋白（Allophycocyanin，APC）

是一种从蓝绿色水藻中分离出来的藻胆（色素）蛋白，与其他藻胆蛋白一样，它的生色团与蛋白质以共价键牢固结合在一起，赋予了其荧光性，用650nm的激光照射后可以发出以660nm为最大峰值的红色荧光。

（三）常见荧光染料的激发光和发射光波长

细胞免疫荧光染色技术常用荧光染料的激发光和发射光波长，见表1-1。

二、核酸荧光染色

（一）核酸荧光染色技术的基本原理

核酸荧光染色技术是指以特异性荧光染料对细胞核或细胞质内的核酸物质（如DNA和RNA）进行染色，通过测定细胞所发出的荧光强度，达到对细胞内DNA、RNA含量的测定，并可以对细胞周期和细胞增殖状况进溴化乙锭行分析的技术。

核酸荧光染色技术的基本原理就是利用了特异性核酸荧光染料具有与DNA、RNA结合的特性。常用的DNA荧光染料如碘化丙啶、4，4，6-二脒基二苯基吲哚等，RNA荧光染料如噻唑橙、吖啶橙等。核酸荧光染料与DNA、RNA的结合方式有3种，即共价结合、嵌入结合和静电亲和。共价结合如FITC、PE和德州红等，嵌入结合如碘化丙啶、溴化乙锭等，静电亲和如吖啶橙等。上述结合方式中以嵌入式结合最为稳定，染料分子可以直接嵌入到核酸碱基对中，洗涤等处理不容易造成荧光分子丢失。

（二）核酸荧光染色技术常用荧光染料及特性

1.碘化丙啶（propyridine iodide，PI）

PI可以稳定嵌入DNA、RNA的双螺旋结构中，主要用于DNA染色，因此染色时需要同时使用RNA酶（RNAase）以降解细胞中的RNA成分，以排除RNA对DNA荧光定量测定的影响。用488nm的激光照射后可以发出610～620nm的橙色荧光，且荧光强度大，十分稳定。同时，PI不能透过活细胞膜，因此不能对活细胞核内的DNA进行染色，可用于鉴别死细胞。故利用PI对活细胞DNA染色必须事先对活细胞进行膜通透性处理，以便PI进入到细胞内。在细胞生物学领域，为了便于染料、荧光标记抗体等顺利进入细胞，而对细胞膜进行的旨在提高其膜通透性的处理，称为打孔（perforation）。

2.溴化乙锭（ethidium bromide，EB）

EB也可以稳定嵌入DNA、RNA的双螺旋结构中，主要用于DNA染色，因此染色时也需要同时使用RNA酶降解细胞内的RNA成分。用488nm的激光照射后可以发出603～610nm的橙色荧光，但发出的荧光强度不及PI。与PI一样，也可用于死细胞的鉴别，当用于活细胞DNA分析时，需要事先对细胞膜进行打孔，以提高膜的通透性。

3.吖啶橙（thiazole orange，TO）

TO是一种常用RNA染料，以静电亲和的方式与RNA结合，用488nm的激光照射后可以发出530nm的黄绿色荧光。TO量子产量高，染色过程简便，对细胞膜的通透性好，可直接用于活细胞内RNA的染色。而且TO的荧光强度与RNA含量之间存在良好的线性关系。

4.4，6-二脒基-2-苯吲哚盐酸（DAPI）

DAPI以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合，在紫外光源的激发下发射出蓝色荧光。其优点是所发出荧光的变异小，特别适合于对石蜡包埋组织DNA进行染色分析。

三、荧光微球捕获染色

荧光微球捕获染色技术是指利用含有不同荧光编码的微米级大小的聚苯乙烯微球，经过某种处理后与作为检测探针的特定生物分子（如DNA、抗体等）连接起来，与存在于液体中的待测靶分子（如DNA、蛋白质、多肽等）发生特异性结合反应，从而对待测靶分子进行流式细胞学检测的一种荧光染色技术。

（一）基本原理

1.制备一系列含有不同种类、不同量荧光色素的聚苯乙烯微球。这种荧光微球由于精确含有特定种类、特定量的荧光色素，被称为荧光编码聚苯乙烯微球，简称荧光编码微球或荧光微球。

2.按照待检对象的不同，设计相应的生物探针并连接到荧光编码微球的表面。如果待检测对象为某基因的SNPs位点，可以分别设计包含这些SNPs位点在内的互补DNA序列寡核苷酸探针，并将每一种不同SNP位点的DNA探针连接到不同的荧光编码微球表面；如果待检测对象为一组蛋白质，可以使用他们各自的特异性抗体作为生物探针，再将每一种作为探针的特异性抗体连接到不同的荧光编码微球表面。需要注意的是，为了尽量简化检测过程，如果待检测对象的性质相似，数量不多，可以尽量选择含有相同种类荧光色素但荧光色素含量不同的荧光编码微球进行实验，这样只需要一个流式细胞仪上的荧光通道，就可以同时区分荧光色素含量不同的荧光编码微球。

3.将标记了不同生物探针的荧光编码微球与待检测标本加入同一个反应体系中，荧光编码微球表面固定的生物探针即可捕获反应体系中存在的待检测对象。如果荧光编码微球上标记的是待检基因的某SNP位点互补DNA探针，检测对象可以是包含该SNP位点在内的某基因的PCR产物，由于PCR使用的引物上标记有特定的与荧光编码微球荧光色素不同的荧光染料，因此流式细胞仪可以以荧光编码微球的荧光色素和PCR产物上的荧光染料进行双参数分析，达到对多个甚至数十个SNP位点的同时检测。如果荧光编码微球上标记的是待检靶蛋白的特异性抗体，检测对象可以是血清、尿液、胸腔积液、腹水、脑脊液、关节液、泪液、细胞裂解上清液、细胞培养上清液等中的蛋白质或多肽等抗原物质，通过抗原抗体的特异性结合反应，荧光编码微球就可以捕获溶解在液体标本中的靶抗原，再加入与荧光编码微球使用的荧光色素不同的另外一种荧光染料标记的靶蛋白或靶多肽特异性抗体，同样可以在流式细胞仪上进行双参数分析，达到对靶抗原检测的目的。

如果在上述过程中，同时使用待检测对象（如细胞因子）的系列浓度标准品，即可制备标准曲线，达到定量分析的目的。

（二）方法学评价

1.扩大了流式细胞学检验技术的应用范围

流式细胞学检验技术是针对单个细胞或颗粒样物质的定量测定技术，无论是对核酸还是抗原的检测，都是基于细胞或颗粒样物质为背景的分析。荧光微球捕获染色技术的发现，为那些存在于液体中、以溶质身份出现的待测对象开辟了流式定量测定的新领域，如血清、尿液、胸腔积液、腹水、脑脊液、关节液、泪液等中的蛋白质或多肽等抗原物质的定量测定，目前已经开发出了如细胞因子组检测、TORCH产前检查、自身免疫测试、激素组检测、SNPs检测、病毒组检测等临床流式诊断试剂盒。

2.检测效率高

利用荧光微球捕获染色技术可以将含有相同种类荧光色素但荧光色素含量各异的一组荧光微球用来标记各种不同的生物探针，还可以用含有2～3种不同荧光色素的多组荧光微球用来标记不同类型的生物探针，结果只需要对临床标本的一次检测，就可以同时测定多项甚至数十项检验指标，检测效率大大提高，甚至可以与DNA芯片、蛋白质芯片相媲美。事实上，流式细胞术采用灵活多样的荧光微球组合，对多种生物信息指标进行检测，就是一种崭新的芯片技术，有科学家将之称为“液相芯片技术”。顾名思义，液相芯片技术就是指以荧光微球作为反应载体，在液相系统中完成生物学反应和测定，而DNA芯片、蛋白质芯片技术是将DNA或蛋白质固定在硅片、玻璃片或膜表面等固相支持物上进行的反应和分析测定。液相芯片技术由于在液相中进行反应和测定，对于蛋白质、多肽等空间构型与活性的保持，较DNA芯片、蛋白质芯片技术更为容易和方便，解决了困扰DNA芯片、蛋白质芯片的技术难题。

3.检测标本用量少

荧光微球捕获染色技术可以对临床微量体液标本进行流式细胞学检测，如脑脊液、泪液、关节液等，标本量达到50～100μl即可。

4.灵敏度高

液相芯片技术的灵敏度较ELISA技术高。

5.重复性好

液相芯片技术的重复性较ELISA技术好，线性范围更宽。

6.检测速度快

利用液相芯片技术检测SNPs，杂交在几分钟内即完成。检测蛋白质组，即便采用双抗夹心法，反应时间也只需要40～60分钟。

7.简便

只需要将荧光微球与标本进行混合，经过短时间孵育后，就可在流式细胞仪上测定。