第一篇　基础理论

第一章　骨骼肌的发生

骨骼肌组织主要由具有收缩功能的骨骼肌细胞组成。肌细胞因呈长纤维形，故又称肌纤维，其细胞膜称为肌膜，细胞质又称肌质。骨骼肌外包裹有结缔组织，肌纤维间有少量结缔组织、血管、淋巴管及神经。骨骼肌一般借肌腱附于骨骼。

产生肌肉的过程称为肌肉发生（myogenesis），能够分化形成肌纤维的细胞称为生肌细胞（myogenic cells）。肌肉发生可以分为几个不同的阶段。第一个阶段在胚胎发生的早期，此时，中胚层形成的体节形成了机体最初的肌纤维，随后以这些肌纤维为模板逐渐产生新的肌纤维附加其上。第二个阶段在出生前后，此时肌组织中出现了生肌祖细胞（myogenic progenitors），它们在大量增殖后又逐渐减少，此时骨骼肌中细胞核数量逐渐增加并最终恒定，同时肌原纤维的蛋白合成到达顶峰。一旦肌肉发育成熟，这些祖细胞会进入静止状态并从此作为卫星细胞（satellite cell）留存在肌组织中。第三个阶段在成年后。同其他不断自我更新的成体器官一样，骨骼肌能够持续替换衰老或损伤的肌纤维而保持肌组织稳定的功能状态。此时的肌肉发生依赖于卫星细胞的激活及其分化为新的肌纤维。而目前研究最广泛的肌肉发生的形式，就是肌肉受损后，大量卫星细胞通过有丝分裂扩增并分化，最后修复受损组织，重建组织的稳态。有趣的是，胚胎时期骨骼肌发生与成年时期骨骼肌再生中，许多转录因子和信号分子都是重叠的。

本章内容将主要从胚胎时期骨骼肌的发生、成人骨骼肌的再生两个方面进行介绍，并探讨调控骨骼肌发生的常见转录因子、信号分子等基因调控网络。

一、骨骼肌的来源

人体的骨骼肌全部来自于三胚层胚盘的中间层——中胚层。胚胎受精第16天，三胚层胚盘形成后，在脊索以及神经管两旁的中胚层细胞增生，形成左、右一对纵行增厚的中胚层组织，称为轴旁中胚层，它们是骨骼肌最早的起源。轴旁中胚层最开始是没有节段性的，最初形成的这种暂时性的、未分节的结构称为前体节中胚层（presomitic mesoderm）。在人胚第17天，轴旁中胚层细胞局部增殖，在神经管两侧从头端到尾端逐渐分化为左右对称的42～44对团块状结构，称为体节（somite）。自枕部至尾部，每个体节均分化出生骨节（sclerotome）、生皮生肌节（dermamyotome），生皮生肌节再分化为生皮节（dermatome）和生肌节（myotome）。来自生肌节的间充质细胞会逐渐分化出前生肌祖细胞（premyogenic progenitors）以及骨骼肌成肌细胞（myoblast）。成肌细胞迁移到预定形成肌肉的相应部位并相互融合，形成多核的骨骼肌纤维，并在肌纤维内出现肌原纤维。至人胚第3个月末，具有典型的横纹结构的骨骼肌出现。躯干和四肢的骨骼肌均由体节分化而来。而头端的轴旁中胚层不形成体节，而形成称为体节球或头节的结构，组织比较疏松，不分化为生骨节和生皮生肌节，而形成头部和颈部的肌肉。

生皮生肌节的细胞高表达转录因子Pax3（paired-homobox 3）和Pax7，而低表达转录因子Myf5（myogenic factor 5）。生皮生肌节的周缘部分会进一步分化为生肌节，这种含有肌细胞的最原始的肌组织的分子特征是高表达肌分化因子（myogenic differentiation protein，MyoD）和Myf5。因此MyoD和Myf5被认为是肌细胞谱系定向分化的分子标记物。在大多数的生肌祖细胞中，MyoD作为Pax3和Pax7下游基因发挥功能，Myf5则与Pax基因相对独立，在同一层次上共同调控肌发生的过程。

（一）体节的形成

体节的形成是从头端向尾端推进的。由于刚开始胚盘长轴还在不断延长，当胚盘头端分化出体节时，尾端仍然存在前体节中胚层的结构。在胚胎发育过程中，许多信号分子都是沿胚胎的中轴呈浓度梯度分布的，这对机体许多结构的形成都是至关重要的，这些信号分子的距离与浓度都能通过调控基因网络导致细胞发生不同的响应。在体节的发生中，这些具有浓度梯度的信号分子包括Wnt、FGF（成纤维细胞生长因子）以及视黄酸。胚胎尾侧部的轴旁中胚层具有最高浓度的FGF与Wnt分子，它们将细胞维持在了未分化的间充质干细胞的状态。细胞离开胚胎尾部后，这些基因的周期性表达停止了，同时由于视黄酸（RA）浓度的逐渐升高，体节逐渐具有了极性，并随后发育为显著的背侧部和腹侧部的分化（图1-1）。

目前的学说认为，体节的发生是在前体节中胚层中进行的一个高度动态的分子过程，它涉及被称为分节时钟（segmentation clock）的分子振荡器，通过周期性产生Notch、FGF和Wnt信号脉冲，以控制体节的产生。

轴旁中胚层的尾段由四个连续的转录区域组成：尾芽（tail bud）、后端前体节中胚层（posterior presomitic mesoderm）、前端前体节中胚层（anterior presomitic mesoderm）以及正在形成的体节（S0）。此处前端（anterior）和后端（posterior）是胚胎学中的定义，分别对应于胚体的头端和尾端，而非解剖学概念中腹侧和背侧。尾芽区包含了轴旁中胚层的祖细胞，它们暴露在高度活跃的Wnt/FGF信号通路中。再往前是后端前体节中胚层，其中的细胞高表达Msgn1（mesogenin 1），在这个区域中，Wnt-FGF通路仍然高度活跃，这对维持轴旁中胚层未分化的特性以及分节时钟的作用十分重要。沿前体节中胚层的后端向前端方向，Wnt/FGF活性梯度也许具有一个阈值，在该阈值上，细胞可以通过激活Mesp2（mesoderm posterior BHLH transcription factor 2）等分节基因的表达对分节时钟作出反应。这个特定的阈值称为确定前线或波前线（determination front or wavefront），此时胚盘中刚形成原条与原结，该阈值大致位于胚盘中前体节中胚层靠尾端三分之一的分界线（图1-2）。跨越确定前线后，前体节中胚层中从后端进入前端的细胞会经历十分剧烈的信号传导、代谢和转录的变化，包括Msgn1的下调以及Mesp2、Pax3、Foxc1/2和Meox1/2的激活。胚胎后端的轴旁中胚层具有最高浓度的成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGF）与Wnt分子，将细胞维持在了未分化的间充质干细胞的状态。同时这些前体节中胚层的细胞有很强的增殖活性，从而不断向头侧迁移，当跨越确定前线后，一方面这些细胞接触到的Wnt/FGF浓度梯度下降，另一方面头端产生的能有诱导分化的RA浓度逐渐升高，于是前体节中胚层的细胞开始发生分化。由于不断有细胞增殖并迁移出来，同时基因表达发生周期性的改变，因而形成了节段性的体节。此外，由于胚盘尾端的轴旁中胚层高表达RA降解酶Cyp26，而使其内部的细胞免受RA诱导的分化作用。

Mesp2在轴旁中胚层上周期性的表达定义了即将形成的体节的前后边界。从胚盘头侧到确定前线，新形成的体节是通过相应Notch信号的周期性激活而获得其前一段体节和后一段体节之间的区分的。前体节中胚层尾侧的细胞为具有高度迁移能力的间充质细胞，而前体节中胚层头侧的细胞则经历了间充质-上皮转换，逐渐形成了围绕间充质核心的背侧和腹侧上皮层组织。这一过程是由轴旁中胚层中的Tcf15调控的，而Tcf15这个在前体节中胚层前端被激活的转录因子是受背侧外胚层表达的Wnt6所调控的。最头端的前体节中胚层中，在Mesp2阳性和阴性细胞之间形成了与脊索方向垂直的横裂，导致中胚层上皮组织块的出现，于是新的体节形成了。肝配蛋白（ephrins）、钙黏着蛋白（cadherin）、Cdc42、Rac1等蛋白都参与了这一组织重塑过程。然而，在分节和/或间充质-上皮转换严重缺陷的小鼠或鸡胚模型中，虽然其之后的分化模式发生异常，但也能观察到轴旁中胚层的分化，以及肌肉和软骨形成，这也暗示了调控轴旁中胚层的分化同调控其分化模式的分子机制是相对独立的。

（二）体节的分化与隔室化发育

在体节形成后，体节便具有了极性，发生了显著的背侧部和腹侧部分化，称为隔室化（compartmentalization）。体节的腹内侧分形成间充质性的生骨节，随后会分化为软骨、骨以及肌腱。而体节的背外侧分仍为上皮性，称为生皮生肌节。生皮生肌节会形成人体除了头部外的所有骨骼肌、棕色脂肪以及背部真皮。在它们形成时，每个体节由一个靠头端的Tbx18阳性隔室和一个靠尾端的Uncx阳性隔室组成，二者各自衍化为上肌节（epimere），又称轴上肌（epaxial muscle）和下肌节（hypomere），又称轴下肌（hypaxial muscle）。在鸡胚中，形成的体节还可以进一步细分为中部和外侧隔室，各自有不同的分化方向，表达不同的基因。外侧隔室的体节细胞会形成四肢或肋间肌的下肌节，而内侧隔室的体节细胞则形成生骨节、背部真皮和躯干中轴部肌肉。

刚形成的体节细胞的分化方向并未确定。移植实验以及体外培养实验均表明，体节各隔室是在周围组织所分泌的因子的诱导下逐渐形成的，这些周围组织包括背侧外胚层、神经管、脊索以及侧中胚层。而诱导这些细胞发生分化的主要信号通路包括Wnt、Shh、BMP和Notch等。

1.Wnt信号通路对体节分化的调控

Wnt蛋白家族的成员对生皮生肌节和生肌节的形成至关重要。通过与它们的胞内受体Fzd（Frizzled）蛋白结合，Wnt蛋白既可以通过激活经典的β-catenin/TCF转录复合体，也可以通过其他的非经典通路发挥功能。在这些决定体节分化规律的Wnt蛋白中，Wnt1和Wnt3由背侧的神经管分泌，而Wnt4、Wnt6和Wnt7a则来源于表面外胚层。动物模型实验中，Wnt1和Wnt3双突变的小鼠胚胎表现为生皮生肌节部分缺失，且Pax3和Myf5表达都下降。在体外培养小鼠体节分化前的中胚层，Wnt1能够大量提高Myf5的表达，而Wnt7a或Wnt6则诱导MyoD的表达。Wnt受体的表达分析表明，Fzd7在体节下轴（hypaxial）部位表达，Fzd1和Fzd6则在体节上轴（epaxial）部位表达，而该部位正是早期表达Myf5的区域。体节上轴部位表达的Wnt1和Fzd1/6极可能是通过经典信号通路调控Myf5表达的，而Wnt7a和Fzd7调控的MyoD的表达，则是通过不依赖β-catenin的非经典的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路进行的。此外，Wnt拮抗剂sFRP3可以剂量依赖性地减少肌纤维在胚胎中的形成和发育，也证明了胚胎肌肉发生需要Fzd信号激活。

2.Shh信号通路对体节分化的调控

Shh（sonic hedgehog）蛋白能正向调控体节中生肌祖细胞的分化。Shh由脊索和神经管底板产生，是Hedgehog蛋白家族的一员，而Hedgehog家族还包括Dhh（desert hedgehog）和Ihh（Indian hedgehog）。哺乳动物Hedgehog蛋白能够与Patched受体互作，导致Smoothened蛋白的释放，并进一步通过GLI转录因子调控基因的转录。Shh或Smoothened基因敲除小鼠都表现出生骨节形成异常，且生肌节内Myf5表达下调。另外，斑马鱼胚胎中Shh信号的缺失会导致体节中高表达Pax3和Pax7的细胞数量增加，并抑制随后的成肌细胞谱系的发生与发育。在鸡胚中，过表达Shh能够上调生骨节分子标记物Pax1，而抑制生皮生肌节中Pax3的表达。这些研究都表明，Shh对生皮生肌节内细胞分化为高表达MyoD、Myf5且低表达Pax3和Pax7的生肌节细胞十分重要。与此相符的是，Myf5基因的调节元件包含有TCF和GLI结合位点，这也能够解释为何Shh和经典的Wnt信号可以协同激活Myf5表达。

3.BMP信号对体节分化的调控

与Shh和Wnt能够正向调控肌肉发生相反，骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）能够抑制肌肉发生的相关基因。BMP蛋白是TGF-β（转化生长因子-β）超家族的一个子家族，因为它们在早期骨形成中的作用而得名。在许多生理环境中，Wnt和BMP蛋白呈时空特异性的关联表达，它们要么共表达，要么呈反向梯度分布，这些都暗示了这两条信号通路之间具有保守的互作机制。BMP蛋白发挥功能是通过丝氨酸-苏氨酸激酶受体激活Smad蛋白，从而激活或抑制下游靶基因。BMP4在侧中胚层表达，可能通过维持Pax3的表达、延迟Myf5和MyoD的表达，使未分化的生肌祖细胞保持稳定的数量。研究提示，过表达BMP能够扩大生肌祖细胞池，避免其过早发生分化。在生皮生肌节的背内侧周缘，Wnt和Shh通过上调noggin（头蛋白）表达来拮抗BMP信号。这样就允许了MyoD的局部上调，并进一步启动了生肌节的形成。与此相符的是，noggin敲除的小鼠胚胎表现出尾部区域生肌节发育受损，同时体节仍维持着未分化的上皮性状态并高表达Pax3。

4.Notch信号通路对体节分化的调控

在胚胎发育中，Notch信号是祖细胞的分化命运的重要调控因子，而Notch信号通路同样在脊椎动物的肌肉发生中有十分重要的作用。Notch是一个位于细胞膜上的跨膜蛋白，通过与相邻细胞上的Delta和Jagged配体结合而介导细胞间的互作。迁移到神经管和体节之间的神经嵴细胞，除了其细胞表面上携带Wnt1蛋白，同样也表达Notch配体Dll1（delta-like 1）。而当生皮生肌节周缘的细胞接触到这些迁移过来的Delta1阳性细胞，Notch通路就被激活。激活的Notch信号能通过抑制GSK3β的活性而增强Snail的稳定性，导致细胞增殖、分层并进入相邻的生肌节，并启动生皮生肌节细胞中Myf5的表达。另一方面，Notch信号还通过DNA结合蛋白RBP-J和转录抑制因子Hes1共同抑制MyoD的表达。Delta1和RBP-J的突变均会导致过度的肌肉分化过程，以及生肌祖细胞的丢失，表明同BMP类似，Notch信号还能够促进生肌祖细胞的扩增，并抑制其分化。

二、胚胎时期骨骼肌的发生

随着胚胎的发育，生皮生肌节中心部位退化，形成中空的结构，进一步分化为生皮节和初级生肌节（primary myotome）。初级生肌节中含有生肌祖细胞，出生以后，骨骼肌中的一部分卫星细胞就是由这些生肌祖细胞形成。随后生肌节又衍化为两个生肌区（图1-3）。一个生肌区靠近体节的背内侧区，该区的细胞向生皮节细胞所在部位迁移，并发育为较小的背侧区，称为上肌节，将形成脊柱的伸肌。而另一个生肌区靠近体节的背外侧区，该区的细胞将向腹侧生长并迁移，形成较大的腹侧区，即下肌节。下肌节将形成四肢和体壁的肌肉。

由下肌节形成的体壁肌肉主要包括：①在颈部将形成斜角肌、颏舌肌和椎前肌；②在胸部分化为三层，分别形成肋间外肌、肋间内肌和胸横肌，由于肋骨的存在，这些肌肉仍保持分节的特征；③在腹部形成腹外斜肌、腹内斜肌和腹横肌，这些最初有分节的肌肉相互融合，形成较大的片状肌肉；④在腰部形成腰方肌；⑤在骶部和尾部分别形成盆膈和直肠下段的骨骼肌。除了腹外侧的三层肌肉外，下肌节的腹侧末端还在腹部形成腹直肌，在颈部形成舌骨下肌，而在胸部，这种纵行的肌肉仅少部分保留下来，形成胸骨肌。

四肢肌肉、横膈膜和舌下肌来源于具有较强迁移能力的成肌细胞。人胚第7周，随着肢芽的形成，一些间充质性质的成肌细胞从生皮生肌节的腹外侧周缘迁移出来，到达肢芽近根部的水平面，并发生致密化，随后进入肢芽内，形成肌肉（图1-4）。随着四肢的伸长，肌组织分裂为屈肌和伸肌两个部分。尽管四肢肌在最初也呈分节状，但后来则形成由几个相邻节段的肌组织相互融合而成的肌肉。

头部所有的肌肉，包括舌肌、眼肌（不含虹膜肌，它来自于视杯外胚层）和与鳃弓相关的肌肉，都来自轴旁中胚层形成的位于胚胎头部的7对体节球，体节球的组织一直比较疏松，也不分化出生骨节和生皮生肌节。下面我们将着重描述胚胎时期骨骼肌发生的分子调控机制。

（一）体节中肌肉发生的启动

在小鼠和鸡胚刚形成的体节中，肌肉发生的第一个标志是体节背内侧细胞开始表达Myf5。首先，背侧部的生皮生肌节高表达Pax3而低表达Myf5，于是生皮生肌节在体节横断面上分成了中心区域（central domain）、背内侧边缘（dorsomedial lip）和腹外侧边缘（ventrolateral lip）。随后，背内侧细胞的Myf5很快发生上调，而Pax3则发生下调。于是，夹在背侧的生皮生肌节和腹侧的生骨节之间出现了一层细胞，这就是初级生肌节（图1-1）。

胚胎中形成的第一个骨骼肌细胞是生肌节中的肌细胞。这些细胞表达特化的细胞骨架蛋白，包括慢肌球蛋白重链（即Myh7，又称Ⅰ型肌球蛋白重链）、胚胎肌球蛋白重链（即Myh3）、α肌动蛋白（心肌为Actc1，而骨骼肌为 Acta1），结蛋白（desmin），还有Notch配体 Jagged2以及代谢酶 β-烯醇化酶、碳酸酐酶Ⅲ等。这些新形成的单个核的肌细胞在Wnt11信号下，延胚盘前-后轴纵向延伸至整个肌节。而从生皮生肌节周缘产生的新的肌细胞会不断添加到生肌节中，这些细胞与已经存在的肌细胞发生融合，逐渐形成Myh7阳性的肌纤维。生肌节形成以后，生皮生肌节的中心区域失去了其上皮性，而Pax3阳性的细胞转移到了生肌节中，进一步形成生肌祖细胞。随着胚胎的伸长和新的体节对依次增加，肌肉发生及成熟的过程也是相应地从头端到尾端呈波型进行。在躯干和四肢的肌肉发生是由一些核心转录因子构成的网络所控制，包括 Pax3 和一组肌肉调节因子（muscle regulatory factors，MRF），包括 Myf5、MyoD、MRF4（Myf6）和myogenin（成肌蛋白）。在胚胎中，myogenin控制了成肌细胞向肌细胞的终末分化。遗传学研究还确定了一组转录因子，它们是骨骼肌发生的上游调节因子，包括Rp58（Zfp238或Zbtb18）、Meox1/2、Six1/4、Eya1/2和Nfix。

（二）初级和次级肌肉发生

胚胎发育过程中的肌肉发生可以分为两个阶段：初级阶段（小鼠为E10.5—12.5；鸡为E3—7）以及次级阶段（小鼠为E14.5—17.5；鸡为E8以后）。第一个阶段产生初级肌纤维，它们由生皮生肌节中的Pax3阳性（小鼠）或Pax3/Pax7阳性（鸡）生肌祖细胞形成。这些初级肌纤维形成了早期的生肌节和四肢肌肉，为构建成体肌肉提供了模板。它们表达了一组特殊的蛋白，包括慢肌球蛋白重链和肌球蛋白轻链1（myosin light chain，MyLC1/Myl1）。在小鼠的第二个阶段的肌肉发生中，一部分Pax3阳性的生肌祖细胞开始表达Pax7，并下调Pax3表达。这些Pax7阳性的生肌祖细胞相互融合，或与初级肌纤维融合，于是形成了次级（胚胎）肌纤维，这些肌纤维开始表达特异的分子标记物，包括β-烯醇化酶、Nfix或MyLC3。与此同时，这些肌纤维也开始表达快肌球蛋白重链。次级肌肉发生中，肌肉生长基本上就是通过成肌细胞融合和加入不断增殖的Pax7阳性的生肌祖细胞来实现的。而这与出生后肌肉生长的方式不同，后者主要是通过在肌纤维胞浆内添加新的肌原纤维导致肌纤维肥大的方式。在次级肌肉发生的同时，还有一群Pax7阳性的生肌祖细胞会进入静止状态，形成成体肌组织中的干细胞——卫星细胞。

（三）肌肉发生中的信号调控

在骨骼肌的发生中，体节周围的胚胎组织会提供重要的诱导信号。如前所述，脊索、神经管以及背侧的外胚层产生的Shh和Wnt信号对肌肉发生十分重要。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）同样能够支持肌肉发生。由侧中胚层产生的HGF对成肌细胞的正确迁移十分重要。胰岛素信号也可以与Wnt信号一同促进肌肉发生以及成肌细胞的融合，而FGF信号能够促进成肌细胞的增殖并抑制其分化。除此之外，还有许多复杂的转录调控因子，构成多个层级的基因网络调控肌肉的发生。

1.肌肉调节因子MRF对肌肉发生的调节

肌肉调节因子MRF是一类具有螺旋-环-螺旋的因子，特异性地在骨骼肌细胞谱系中表达，包括MyoD、Myf5、myogenin以及MRF4（Myf6），能够诱导非肌细胞分化为成肌细胞，或诱导成肌细胞融合形成肌管（myotube），即肌纤维的前体细胞。MRF的基本结构域能介导DNA结合，而螺旋-环-螺旋基序（motif）负责与E蛋白形成异二聚体。E蛋白能够识别基因上的E框，这是在许多肌肉特异性基因的启动子上发现的基序。Myf5是在胚胎发育中最早表达的MRF基因，在轴旁中胚层中短暂上调，并进一步诱导了生肌节的形成。小鼠MyoD和Myf5单敲和双敲模型表明，二者的敲除会导致肌肉的完全缺失，但二者间呈明显的冗余补偿关系。研究者利用诱导白喉毒素表达而条件性消除胚胎中Myf5阳性细胞后发现，生肌节仍然可以部分形成，说明并非所有形成生肌节的细胞都表达Myf5。而在细胞中过表达MyoD则可以完全抵消Myf5阳性细胞缺失的影响，且二者是由不同的上游调控因子所控制。之后的研究还表明，Myf5和MyoD位于其他MRF基因的上游，它们主要负责诱导成肌细胞的形成，而myogenin和Mrf4则更直接地参与随后的分化过程并触发肌管特异性基因的表达。这些结果都表明肌肉组织由不同起源或特性的细胞共同融合形成，具有显著的异质性和可塑性，且这种特点不仅存在于胚胎中，还存在于成人肌源性祖细胞池中，我们还将在后续的章节中进一步描述。

2.配对同源盒转录因子Pax对肌肉发生的调控

转录因子Pax3和Pax7能在另一个层级上调控肌肉发生。Pax家族基因在物种上十分保守。小鼠的生皮生肌节细胞能表达Pax3和Pax7，其中中心区域高表达Pax7，而背侧和腹侧边缘则高表达Pax3。然而，在长距离迁移的细胞中则只有Pax3表达，因而Pax3参与了四肢肌肉的发生。研究表明，Pax3位于MyoD基因的上游，而Pax3：Myf5：MRF4三重基因突变会导致小鼠全身所有肌肉的缺失，也无法检测到MyoD和所有其他下游肌源性因子的表达。与Pax3不同，Pax7对胚胎的肌肉发生并不是必不可少的，但Pax3和Pax7双敲会导致胚胎中更严重的肌肉缺失，仅有早期生肌节的发育，说明二者之间也存在一定的补偿作用。利用诱导白喉毒素表达而条件性消除Pax3阳性细胞会导致胚胎致死，且没有Pax7阳性细胞的出现，而消除Pax7阳性细胞却只会导致发育后期的肌肉缺陷，如出生时四肢肌肉较小、肌纤维较少。因此有推测认为，Pax3阳性细胞是在四肢肌肉发生中形成初始肌纤维模板的生成细胞，而Pax7阳性细胞在随后的过程中通过形成次级肌纤维和建立卫星细胞池发挥功能。

3.转录因子Six蛋白对肌肉发生的调控

目前认为，Six1（sine oculis-related homeobox 1）和Six4蛋白位于调控肌肉发生的基因级联网络的顶点，可诱导生皮生肌节中的祖细胞形成成肌谱系细胞。Six蛋白家族同样是一类转录因子，包含两个保守的结构域，一个为能够结合DNA的Six同源域，另一个是与转录共激活因子或辅阻遏因子相互作用的氨基末端Six域。Six蛋白与Eya1和Eya2结合并转位进入细胞核，随后激活Six的下游靶基因Pax3、MyoD、MRF4和Myogenin。与同在其下游的Pax3和Pax7相似，Six-Eya也具有互补冗余的关系，单个基因突变仅具有较轻的缺陷，但二者的共同缺失会导致严重的肌肉发生缺陷。

4.miRNA对肌肉发生的调控

许多miRNA也在肌细胞中特异性高表达，这些miRNA几乎参与了肌肉发生的所有阶段。目前的研究已发现大量miRNA可以通过靶向MyoD、myostatin、Mef等基因调控肌肉发生，还可以通过作用于IGF-Akt-mTOR信号通路以及TGF‐β信号通路影响肌肉发生。

（四）成肌细胞的融合，肌原纤维与基膜的形成

成熟的骨骼肌纤维内含有由整齐排列的肌原纤维组成的具有高度结构化的细胞骨架。骨骼肌纤维首先通过成肌细胞融合形成多核肌管，进一步成熟为肌纤维。肌管是形成成熟骨骼肌纤维的一种过渡性结构，由成肌细胞首尾融合形成，细胞核位于细胞中央成排排列，细胞核外具有收缩功能的肌丝正在形成，这些肌丝很快就会有规律地排列形成肌节，从而组装为肌原纤维。因此，在并未完全成熟的肌纤维表面也可观察到横纹的结构。成肌细胞-成肌细胞融合和成肌细胞-肌管融合的过程受到高度调节，但在脊椎动物中仍然知之甚少。在果蝇中，肌肉融合由两种不同类型的成肌细胞协同：一为有限数量的创始细胞，建成细胞亚群启动与周围成肌细胞的融合；二为具有融合能力的成肌细胞，成肌细胞产生基于肌动蛋白的足突状结构，侵入创始细胞并形成穿孔，允许细胞质和细胞核从成肌细胞转移到创始细胞。在脊椎动物中，成肌细胞融合是由表面受体的识别和黏附所起始，也有证据表明肌动蛋白动力学、参与内吞作用和膜修复途径的蛋白都在此过程中发挥重要作用。在出生后，肌纤维的延长是通过在其末端融合新的成肌细胞而介导，这一过程依赖于TGF-β信号。细胞因子IL-4也被证明可以控制成肌细胞融合，通过作用于下游的NFATC2控制成肌细胞与肌管的融合。

肌原纤维的发生是指在大部分肌浆中填充肌原纤维，这些肌原纤维将延伸到肌纤维的两端并锚定到肌腱连接处。肌原纤维由肌节串联而成。每根肌纤维也被一层特化的基膜单独包围。肌膜（肌细胞膜）通过肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物（dystrophin-associated glycoprotein complex，DGC）这一跨膜蛋白复合物将肌纤维细胞骨架与细胞外基质相连接，将肌纤维锚定到基膜上。横小管和终池形成的三联体是在出生前后形成的，也与肌原纤维的发生密切相关。

三、成体肌肉的发生与发展

与胚胎时期的肌肉发生不同，高等脊椎动物成体肌肉发生称为肌肉再生（muscle regeneration），依赖于受损肌组织处所留存的细胞外基质支架，该支架将作为肌肉再生中肌纤维形成的模板。在体内，受损组织再生需要将未分化的祖细胞募集到损伤部位，而在成熟的骨骼肌中，此功能由卫星细胞完成。卫星细胞的激活同样依赖于胚胎期调控肌肉发生的基因。卫星细胞已被证明通过不对称分裂进行自我维持，分裂产生的两个子细胞中的一个已向成肌细胞谱系分化。还有研究证明，卫星细胞可以分化为几种不同的同属于中胚层来源的细胞谱系，包括肌肉、骨骼和棕色脂肪。因此，卫星细胞的特点真正满足成体干细胞的标准：自我更新的能力以及分化产生几种不同后代细胞类型的能力。又因为卫星细胞群体的高度异质性，这种在成年后体内留存的高度未分化的细胞，引起了研究者的广泛关注。

（一）卫星细胞微环境

成体干细胞都存在于一个特殊的干细胞微环境（stem cell niche）中，这样的微环境能够维持干细胞的自我更新，并抑制其分化。而卫星细胞则特别依赖于其所在的微环境。卫星细胞紧邻骨骼肌纤维并被该肌纤维的基膜所包裹，通常位于物质交换活跃的毛细血管附近。除非肌肉损伤或被其他刺激激活，卫星细胞的微环境会使成体肌组织中的卫星细胞一直保持静止的非增殖状态，而这对于它们在肌组织中终身存在和维持至关重要。然而，利用卫星细胞治疗肌病只有较低的成功率，究其原因，也与卫星细胞对其所在微环境的依赖性相关。当卫星细胞从其微环境中脱离出来，就会不可逆地迅速分化为成肌细胞，大量表达Myf5、MyoD以及myogenin，因此人们很难在体外对卫星细胞进行扩增和培养。为了克服这一困难，研究者考虑通过移植未分化状态更高的胚胎干细胞或者诱导型多能干细胞（iPS）来实现。在小鼠模型中，Pax3和Pax7重编程产生的小鼠祖细胞均能成功移植到肌肉中，而Pax3或Pax7重编程的人多能干细胞（hPSC）可以产生 CD29（ITGβ1）⁺/CD44⁺/CD56⁺和 CXCR4^-/CD106（VCAM1）的肌源性祖细胞，并且可以成功移植到小鼠肌肉中。

（二）卫星细胞的起源

所有的成熟肌组织中的卫星细胞均表达Pax7，而在如膈肌等一些特殊的肌肉中，卫星细胞也维持了Pax3的表达。这些成体卫星细胞是来源于生皮生肌节中心区域中Pax7阳性的生肌祖细胞。有趣的是，来自肌肉以外的其他谱系的细胞也被证明具有生肌潜力，例如骨髓来源的祖细胞、骨骼肌侧群细胞（skeletal muscle side population cells）、中胚层成血管细胞、血管周细胞、CD133（Prom1）阳性的祖细胞和PW1（Peg3）阳性的间质细胞，它们都能够参与肌管的形成。然而，当成年肌组织中表达Pax7的卫星细胞被消除，而卫星细胞池无法得到补充，此时损伤的肌组织却无法得到修复，这表明表达Pax7的卫星细胞是成人肌纤维再生的主要因素。此外，Notch信号对于维持Pax3/Pax7阳性的生肌祖细胞池是必不可少的，缺失Notch信号则不能形成卫星细胞。

肌肉总量增长的高峰期为胎儿期和出生前后，在此期间生肌祖细胞积极分裂，占比可高达小鼠肌组织中单个核细胞的30%，然而在出生后2个月内，这些祖细胞的数量迅速减少，形成静止的Pax7阳性卫星细胞，仅占成年小鼠肌组织中单个核细胞的百分之几。在小鼠中，卫星细胞在胎鼠晚期（大约E18.5）被包围在肌纤维的基膜下。尽管Pax7对于成熟卫星细胞的分化不是必需的，但Pax7突变小鼠会逐渐丢失卫星细胞。

（三）卫星细胞池的维持

骨骼肌具有很强的再生能力，即使经历多轮损伤，卫星细胞池仍保持恒定大小，这表明在卫星细胞中要么存在能够自我复制的补充细胞亚群，或卫星细胞池本身能够自我更新。而自我更新则需要细胞的随机分化或不对称分裂。在随机分化模型中，一个卫星细胞分裂形成两个已发生分化的子细胞，而另一个卫星细胞则产生两个与之完全一致的子细胞，以维持祖细胞池的恒定规模。而在不对称分裂模型中，每次分裂则分别产生一个维持干性的子细胞，以及一个已发生分化的子细胞。卫星细胞不对称分裂的行为已经通过DNA示踪实验观察到。而通过荧光示踪实验进一步发现，在卫星细胞中约有10%的细胞不表达Myf5，这些Myf5阴性细胞会在与相邻骨骼肌基膜垂直的方向上发生不对称分裂，形成一个分化的Myf5阳性细胞以及一个完成了自我复制和更新的Myf5阴性细胞。当把这些Myf5阴性和Myf5阳性的卫星细胞分别移植入卫星细胞耗竭的肌肉中时，Myf5阴性的卫星细胞较Myf5阳性的卫星细胞具有更强的定植和扩增能力。也有实验在体外培养的肌纤维中观察到，在同时表达Pax7和MyoD的已发生分化的卫星细胞中，仍有一个亚群的细胞能够通过不对称分裂产生Pax阳性而MyoD阴性的细胞。

上述实验证明，在卫星细胞池中具有一个可以发生不对称分裂的细胞亚群，它们通过复杂的自我更新机制以维持卫星细胞池的恒定大小，并抑制卫星细胞发生谱系进展和终末分化。

（四）成体肌肉发生的外部调控

卫星细胞微环境中的多种信号分子控制着成年小鼠肌组织中卫星细胞的命运。与胚胎肌肉发生过程类似，Wnt蛋白是出生后肌肉发生过程中卫星细胞分化和自我更新的关键调节因子。Notch信号主要作用于成熟骨骼肌损伤后卫星细胞池的扩增，而其向经典Wnt3a信号的转变则对成肌细胞的分化和肌肉再生是必需的。而再生的肌纤维中释放的Wnt7a，能够通过与Fzd7受体结合，介导非经典的平面细胞极性信号（planar cell polarity），诱导Myf5阳性的卫星细胞在平行于相邻骨骼肌基膜的方向上发生对称性分裂，参与控制卫星细胞自我更新与分化。Wnt7a介导的卫星细胞池扩张已被证明可显著增强肌肉受伤后的再生能力。此外，在成年人肌肉再生中，成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、肝细胞生长因子（HGF）和转化生长因子β（TGF-β）通路都对卫星细胞的激活十分重要。另一个在成年肌肉发生中有重要功能的蛋白是肌生成抑制蛋白（myostatin，Gdf8），myostatin缺失会导致肌肉过度肥大。

这些成体肌肉发生中的外部调节因子同样与它们在胚胎时期肌肉发生中的功能类似，一些蛋白阻止谱系分化进展，同时促进损伤后未分化的卫星细胞池的扩增，而其他的蛋白以拮抗的方式促进MRF的上调，并随后建立起肌纤维分化中细胞融合的分子机制。而针对这些分子途径开发药物以动员患病肌肉中的卫星细胞，是增强成体肌组织自身再生能力以及治疗肌少症等肌肉相关疾病的很好的切入点。然而，由于目前仍无法在体外培养能够维持其干性的卫星细胞，严重阻碍了治疗性化合物的筛选工作。因此，通过诱导多能干细胞定向分化为卫星细胞或诱导胚胎干细胞分化为其他成肌谱系细胞也是当前研究的热点。

综上所述，肌肉发生是一个十分复杂的过程，是多种转录因子与信号级联通路相互作用的结果。这些信号分子和转录因子可以在反馈和前馈循环中发挥协同或拮抗作用。这些复杂的级联调节信号共同协调了胚胎发育中的肌肉发生，并重新激活了成体肌肉的修复过程。而随着技术的进步，研究人员一方面能更容易地在蛋白质组和全基因组层面研究控制肌肉发生的生物调控网络，另一方面可以通过体外诱导的iPS细胞或ES细胞定向分化为成肌谱系细胞。因此，高通量数据分析与整合生物学实验的结合将成为未来研究肌肉发生领域的重要组成部分，最终在体外和体内有效地操纵生肌祖细胞和卫星细胞的行为和功能，并将其应用于再生医学。

（穆欣艺）

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